木霉蛋白质及功能
木霉中蛋白质是细胞壁的主要组分之一，共220种细胞壁相关蛋白被分别从里氏木霉（T.reesei）合成并分泌蛋白的菌丝体和蛋白分泌水平低的菌丝体中提取并分离（Lim et al.，2001）。并发现在这两种菌丝体中最丰富的蛋白为HEX1，是丝状真菌特异结构伏鲁宁体（Woronin Body）的特异蛋白。其他分离的蛋白还包括液泡蛋白酶A、烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、转醛醇酶、蛋白质二硫键异构酶、线粒体外膜孔蛋白、二磷酸激酶和翻译延伸因子β等（Lim et al.，2001）。木霉是一种土传丝状真菌，具有生物防治特性。哈茨木霉（T.harzianum）可以防止多种作物的病原菌生长，可以替代目前市场上的化学试剂作为生物杀菌剂。目前蛋白质组学已被用于木霉中生物防治相关蛋白质的分离和鉴定（Grinyer et al.，2004a）。Grinyer等（2004b）开发了在酸性条件下提取蛋白质的方法，这种方法增加了碱性蛋白质的溶解性，消除了微生物的酸性细胞壁假象。这种方法结合蛋白酶抑制剂制备的哈茨木霉（T.harzianum）样品，数百蛋白被提取并通过双向电泳被分离。同时，利用蛋白质组方法分离并鉴定了哈茨木霉（T.harzianum）对细胞功能至关重要的线粒体中的蛋白质。不同木霉菌株蛋白含量和种类存在差异，Adav等（2013）对在四种（葡萄糖、纤维素、淀粉、淀粉和纤维素混合物）不同碳源中生长的里氏木霉（T.reesei）QM6a和Rut-C30突变株共8个样本的蛋白丰度利用复样本（PAMUS）的蛋白质丰度测定方法进行了测定，结果显示，Rut-C30内纤维素水解酶含量较高，具有很高的纤维素水解能力。基于色谱方法和双向电泳的方法，对里氏木霉（T.reesei）中蛋白颗粒进行了鉴定，通过双向电泳（2DE）分离的102个点利用跨物种识别（CSI）质谱或来自里氏木霉（T.reesei）测序项目的蛋白数据库的分析发现其中有30个为20S颗粒，8个为19S的粒子。另外，对蛋白酶体相互作用的蛋白质，以及一些非蛋白酶相关蛋白进行了鉴定（Grinyer et al.，2007；Kautto et al.，2009）。木霉菌还具有复杂的胞外蛋白水解系统，可以分泌大量胞外蛋白酶，是细胞壁降解酶的重要组分。胞外蛋白酶通过营养竞争，协同降解植物病原菌细胞壁和根结线虫体壁，参与木霉的生物防治（陈蕾蕾等，2010）。目前，分析哈茨木霉（T.harzianum）、黄绿木霉（T.aureoviride）、绿色木霉（T.viride）的胞外蛋白酶谱，发现这3种木霉都可以分泌胰蛋白酶类似蛋白酶和胰凝乳蛋白酶类似蛋白酶。木霉还可以分泌一些作为毒素或信号分子的蛋白质。三种木霉——里氏木霉（T.reesei）、绿木霉（T.virens）、深绿木霉（T.atroviride）的基因组和蛋白质序列已由美国能源部联合基因协会（DOE JGI）联合基因组研究所测序并进行标注（Grigoriev et al.，2011）。木霉蛋白质的分泌组学也通过硅片工具的蛋白序列分析进行了预测（例如，Petersen et al.，2011；http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），通过N-末端含有向内质网转移的用于翻译后加工和分泌的信号序列筛选分泌蛋白。预测的木霉分泌蛋白包括含有信号肽的蛋白、胞外蛋白、糖基水解酶、蛋白酶、氧化酶、小的富含半胱氨酸分泌蛋白和一些功能未知蛋白及其他蛋白等，通过DOE JGI测序的木霉基因组中分析获得的里氏木霉（T.reesei）、绿木霉（T.virens）、深绿木霉（T.atroviride）三种木霉的分泌蛋白相关的基因如表5.1所示（Druzhinina et al.，2012）。木霉不能降解木质素，因此，在生长环境中其主要降解底物为多糖。基于此，糖基水解酶占木霉分泌组比例大约为15%，包括了200个预测的碳水化合物活性酶（CAZymes）中的122个（Martinez et al.，2008）。木霉中的蛋白酶是真菌中最大蛋白组之一（Rawlings et al.，2012）。预测里氏木霉（T.reesei）中总的蛋白酶数目为383，占所有预测蛋白质编码基因的4.2%；深绿木霉（T.atroviride）中数目为445，占所有预测蛋白质编码基因的3.75%；绿木霉（T.virens）中数目为479，占所有预测蛋白质编码基因的3.85%。而且20%的预测蛋白酶具有信号肽并因此进入分泌途径。主要包括天冬酰胺蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、枯草溶菌素类蛋白酶、二肽和三肽基肽酶（表5.2）（Druzhinina et al.，2012）。表5.1 木霉中预测的分泌组的组成（Druzhinina et al.，2012）表5.2 木霉分泌组中蛋白水解酶木霉分泌组中还包含了大量的细胞色素P450蛋白。它们是一类序列相关的血红素加氧酶，这类酶在很多生物中被发现，其功能涉及从原核生物、低等真核生物和植物的碳源降解和代谢产物描述到昆虫、哺乳动物包括人的外源性化合物解毒（Kelly et al.，2006；Singh et al.，2011）。然而，它们最重要的作用是有害物质的细胞外失活（Roelofs et al.，2012；Syed et al.，2012）。最后，木霉分泌蛋白还含有一类小的富含半胱氨酸分泌蛋白（SSCPs），是最大分泌蛋白家族之一。它们被分离的标准为氨基酸残基不多于300个并且含有4个或更多的半胱氨酸残基（Martin et al.，2008；Kubicek et al.，2011）。序列相似性搜索工具和系统进化分析将这一家族蛋白分为四组：①疏水和疏水类似蛋白；②诱导子类似蛋白；③类MR-SP1（MAP激酶抑制分泌蛋白1）蛋白，该蛋白分子量为16-kDa，在绿木霉（T.virens）Δtmk1（MAPK）突变体中强烈高表达并且具有保守的四-半胱氨酸基序C-X29-C［P/G］C-X31-C；④没有归属于任何功能类别的SSCPs（Kubicek et al.，2011）。疏水蛋白是SSCPs家族中被研究最多的蛋白，其特点是含有8个位点保守的半胱氨酸残基，其中4个成对存在。它们存在于菌丝和分生孢子的细胞壁外表面，介导真菌和环境的相互作用。由于疏水蛋白可以改变表面属性，而且既无细胞毒性也无强免疫原性，可以用于果蔬保鲜（Wosten，2001），可促进土壤中污染物的降解，还可应用在石油泄漏后回收石油的过程中（Scholtmeijer et al.，2001），可以作为蛋白和细胞固定化的媒介，将特定分子固定在膜的特定面（Palomo et al.，2003）。木霉中已被发现不止一种疏水蛋白，比如里氏木霉（T.reesei）的 HFB系列包括HFBI和HFBII（Nakari-Setälä et al.，1997；Linder et al.，2001；Askolin et al.，2001，2005）（详见第16章）。根据其在溶剂中的溶解度不同和保守半胱氨酸之间的疏水性分布和间距，疏水蛋白可被分为两类（Ⅰ类和Ⅱ类）。木霉中含有最丰富的Ⅱ类疏水蛋白（Kubicek et al.，2008a）。深绿木霉（T.atroviride）和绿木霉（T.virens）中也存在Ⅰ类疏水蛋白，但里氏木霉（T.reesei）中不存在，但这两种木霉中的Ⅰ类疏水蛋白与其他真菌中的Ⅰ类疏水蛋白在许多方面存在差异，并在子囊菌系统发育分析中形成独立的分支（Seidl-Seiboth et al.，2011）。第二类SSCPs家族蛋白为新兴的诱导子类似蛋白。其中，绿木霉（T.virens）中与深绿木霉（T.atroviride）EPL1（Seidl et al.，2006）同源的基因Sm1已被详细研究，它可以诱导棉花的系统性抗病反应，并通过茉莉酸途径诱导玉米的系统抗病性（Djonovic et al.，2007a）。因此，这类SSCPs蛋白有助于木霉和植物的相互作用。事实上，SSCPs的这一作用在一些植物病原真菌中已有报道（Rep，2005）。木霉中最大的也是木霉特有的一组SSCPs——第四类SSCPs的功能目前还未知。然而有趣的是，这一组的一些成员包含CFEM域或糖基化保守序列（GPI锚定位点）这些基因中的保守性表明它们可能编码在与其他生物的相互作用中起重要的作用的细胞表面蛋白（Pérez et al.，2011）。另一方面，木霉菌也被用来生产小线形抗菌肽段，称抗菌肽（Rebuffat et al.，1995）。由绿木霉（T.virens）产生的抗菌肽段丙甲菌素（Cafiso，1994；Leitgeb et al.，2007），是疏水性的，长20个残基，含有丰富的a-氨基异丁酸（Meyer et al.，1967）。它的疏水性，使其能够被插入生物膜形成非特异的跨膜离子通道，并且对周围膜脂没有干扰（Bertelsen et al.，2012）。插入后，细胞渗漏，并最终裂解（Jen et al.，1987）。大多数抗菌肽为11氨基酸，目前，在绿木霉（T.virens）、里氏木霉（T.reesei）和深绿木霉（T.atroviride）中发现14-氨基酸残基的抗菌肽，并发现了抗菌肽合成酶（非核糖体肽合成酶）（Mukher-jee et al.，2011；Degenkolb et al.，2012）。丝裂原活化蛋白（MAP）激酶调节的形态和遗传过程，确定细胞的命运。绿木霉（T.virens）中编码MAP激酶的基因为tvk1，通过液体培养的野生型和Dtvk1 间cDNA消减杂交间，5个编码疏水类似蛋白的基因（Tv-hfb1，Tv-srh1，Tv-cfth1，Tv-qid3和Tv-ccg14/TvSm1）和两个编码细胞壁蛋白的基因（Tv-qid74和Tv-hfb3）被分离鉴定（Mendoza-Mendoza et al.，2007）。
里氏木霉（T.reesei）的基因组
T.reesei是工业上纤维素酶和半纤维素酶的主要生产来源，这些酶用于将生物质解聚成简单的糖类，再转化成化学中间体和生物燃料例如乙醇。对T.reesei的基因组进行测序（Martinez et al.，2008），将reads组装成89个scaffold，大小为34Mbp，包含9219个基因。出乎意料的是，相比其他已测序的能降解植物细胞壁多糖的真菌，T.reesei基因组中编码的纤维素酶和半纤维素酶基因数目较少。许多T.reesei的碳水化合物活性酶编码基因并非随机分布，而是成簇地分布在与其他粪壳菌纲（Sardariomycetes）真菌的共线性区域之间。7.2.1.1 T.reesei基因组的特点利用鸟枪法对T.reesei的基因组进行测序，构建了3个文库，插入片段的大小分别为3kb，8kb和40kb，覆盖度为9倍，共得到 433863个 reads，利用 Jazz，Phred/Phrap/Consed等软件将这些数据组装成89个scaffold和97个contig，大小约为34Mb（Martinez et al.，2008）。比几个核型分析预测的基因组大小约大2.9%（Carter et al.，1992；Man-tyla et al.，1992；Herrera-Estrella et al.，1993），与物理方法预测的大小几乎一致。核型分析所用的遗传标记和在Genbank中发布的所有蛋白和RNA序列在该基因组中都能找到。因此，推测该基因组序列代表了T.reesei 99%以上的基因组信息。在基因组中发现了类似于I和II型转座子的重复序列，但都存在多个终止密码子。造成缺少活跃转座子的原因可能是由于T.reesei存在活跃的防御机制，例如重复诱导的点突变。这些转座子总数不超过基因组序列的1%，是目前已知的出现频率最低的真菌之一。在T.reesei的7个scaffold末端存在重复6核苷酸序列TTAGGG，该序列与粉红面包霉（Neurospora crassa）端粒重复序列相同。预测T.reesei 基因组含有9129个基因，与N.crassa中的基因数目相当（Galagan et al.，2003），但是比禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum，其有性态为Gibberella zeae）预测的基因数少了接近2500个（Cuomo et al.，2007）。T.reesei基因的平均大小为1793 bp，每个基因平均含有3.1个外显子，外显子的平均长度508 bp，内含子平均大小120 bp。7.2.1.2 T.reesei保守共线性为了解环境因素对基因组进化的影响，比较了T.reesei，F.graminearum和N.crassa共线性的区域。根据比较结果，推测许多基因组片段中基因的顺序在该种类出现时就已经改变，共线性的区段间存在很大的间隙（Galagan et al.，2005）。在很多情况下，T.reesei和其他粪壳菌纲（Sordariomycetes）真菌中这种间隙是很保守的。非共线性的区域通常包含对菌株适应性重要的基因（Galagan et al.，2005；Machida et al.，2005；Nierman et al.，2005）。另外一个值得注意的特点是在3个真菌（T.reesei，F.graminearum和N.crassa）中存在一些随种类出现就已发生的染色体重排，表明了基因组的高度动态性。7.2.1.3 T.reesei的蛋白结构域与盘菌亚门（Pezizomycotina）的其他真菌相比，T.reesei基因组中已知功能的蛋白质数量较少，与生物质降解有关的蛋白组成也不一样。T.reesei缺少与侵染和降解植物活体组织相关的蛋白，例如果胶裂解酶和果胶酯酶，这与其腐生习性相符。而且，在T.reesei中没有发现鞣酸酶和阿魏酸酯酶，表明其在半纤维素降解方面存在缺陷。7.2.1.4 T.reesei和其他真菌中的碳水化合物活性酶在CAZy数据库中，碳水化合物活性酶（Carbohydrate-active enzymes，CAZymes）被分为不同的级别和种类。能切割、构建和重排寡糖和多糖的CAZymes在真菌生物学中扮演重要的角色，对优化生物质的降解也同样重要。尽管T.reesei是植物多糖的有效降解者和降解研究体系中的重要模式菌，但是在其基因组中含有的糖苷水解酶（GH）编码基因较少。T.reesei中仅含有200个GH编码基因，比植物病原菌Magnaporthe grisea（231个）和F.graminearum（243个）都少。T.reesei中含有103个糖基转移酶，接近粪壳菌纲（Sordariomycetes）中该类酶的平均数（96个）。在粪壳菌纲中，该酶类的变异性比GH小。这种趋势在世系内外皆存在，表明糖基转移酶控制的是比较基础性的胞内生命活动，其组成变化所反映的是物种的差异而非环境压力的不同。与植物多糖解聚过程有关的酶，通常携带一个碳水化合物结合组件（Carbohydrate-Binding Module，CBM），该组件连接在催化区上。在已知的粪壳菌纲中，T.reesei的基因组中含CBM的蛋白数量最少。同样，T.reesei中碳水化合物酯酶的数量也是粪壳菌纲中最少的。包括T.reesei在内，粪壳菌纲真菌中相对缺少多糖裂解酶基因，而散囊菌纲真菌（Eurotiomycetes）含有的多糖裂解酶数量较多，平均有18个。在单细胞子囊菌纲（Ascomycetes）中没有发现多糖裂解酶。出人意料的是，在T.reesei基因组中仅发现了7个编码已知纤维素酶（内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶）的基因，在表7.4列出的能降解植物细胞壁的真菌中，T.reesei的纤维素酶基因的数量最少。如果加上GH61蛋白家族，这种趋势更加明显。半纤维素包含不同种类的多糖，完全降解它们需要一系列的酶。T.reesei基因组仅含有16个半纤维素酶基因，也是在真菌中数量较少的。同样，其分解果胶的酶数量为5个，也是在植物细胞壁降解真菌中数量较少的（Martinez et al.，2008）。表7.4 真菌基因组中的纤维素水解酶注：a纤维素种类：CBH1，外切纤维二糖水解酶Ⅰ，GH7；CBH2，外切纤维二糖水解酶Ⅱ，GH6；EG1，内切葡聚糖酶Ⅰ，GH7；EG2，内切葡聚糖酶Ⅱ，GH5_5；EG3，内切葡聚糖酶Ⅲ，GH12_1；EG4，糖苷水解酶家族，Cel61，GH61；EG5，内切葡聚糖酶基因Ⅴ，Cel45。7.2.1.5 蛋白分泌T.reesei能非常有效地分泌胞外酶，有些工业菌株1L培养液可以产生100g胞外蛋白（Cherry et al.，2003）。在T.reesei中发现了与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌途径中起作用蛋白的同源蛋白。这些蛋白多数是单拷贝，与酵母蛋白的相似性比与哺乳动物源相似蛋白的相似性更高。T.reesei含有三个与酵母的蛋白质二硫键异构酶（Pdi lp）同源的蛋白，这可能与T.reesei分泌的纤维素酶多数含有二硫键有关（Divne et al.，1994）。酵母der1和ufd1基因在T.reesei中都存在两个直系同源基因，它们与内质网相关的蛋白降解（ERAD）途径有关。此外，在T.reesei中发现了大多数已知ERAD组分的同源蛋白，但在Aspergillus niger基因组中却缺少ERAD组分同源蛋白（Pel et al.，2007）。这些数据表明，在T.reesei中，ERAD途径似乎比内质网分泌途径更过剩。S.cerevisiae中参与蛋白运转相关的蛋白直系同源物大多数能在T.reesei中找到，它们多数是单拷贝。酵母缺少与哺乳动物GTPase蛋白Rab2，Rab4，Rab5，Arf6和Arf10对应的蛋白，这些信号蛋白参与膜融合或囊泡的出芽，而在T.reesei和N.crassa中含有这些蛋白的直系同源物。酵母中质膜分泌小泡受体t-SNARE蛋白Sso1p，在T.reesei中有两个同源蛋白，研究表明，这两个Sso1同源蛋白具有不同的功能（Valkonen et al.，2007）。综上所述，这些研究表明T.reesei的膜运输系统比在S.cerevisiae中的更加多样化。7.2.1.6 T.reesei的CAZyme基因簇T.reesei中许多CAZyme的编码基因在基因组中不是随机分布的。有研究表明，9个与纤维素和半纤维素降解有关的蛋白编码基因共同分布在基因组的几个区域。通过对T.reesei基因组中所有CAZyme的编码基因定位发现，316个CAZyme中的130（41%）分布在25个不连续的区域，这些区域大小从14 kb到275 kb不等（总共约2.4Mb，约占基因组的7%）。这些区域中含有CAZyme基因的密度比随机分布基因密度大5倍。通过对基因簇中基因数量的分析，130个CAZyme的95个（73%）分布在基因组共线性区域的间隙。而这95个中的69个（72%）在F.graminearum含有直系同源物。有16个CAZyme与F.graminearum共线性，表明基因迁移是这些基因簇形成的主要因素，而基因复制的作用较小。在同一基因簇中的CAZyme基因很少是出自同一个CAZyme家族，这也表明基因的迁移在这些基因簇形成过程的作用比基因复制更大。CAZyme基因成簇分布表明其特殊的生物学功能，在基因簇中的CAZyme基因有70%编码GH。基因组中有24%的糖基转移酶基因和46%的GH基因分布在这些基因簇内，表明这些基因簇中的CAZyme基因大多数参与多糖的降解。与植物细胞壁降解有关的基因多数分布在富含CAZyme的区域的现象，也证实了这一点。T.reesei中有4个类似于扩展蛋白的基因（Saloheimo et al.，2002），其中3个分布在这些基因簇内。有趣的是，少量与真菌细胞壁合成有关的糖基转移酶编码基因也出现在CAZyme基因簇中，比如甘露糖基转移酶、几丁质合酶、a-糖基转移酶和β-糖基转移酶（Cabib et al.，2001）。结合对槐二糖和纤维素诱导的T.reesei转录组数据进行分析（Foreman et al.，2003），将槐二糖和纤维素诱导表达基因定位到基因组上，发现尽管不是所有成簇分布的GH基因都共表达，但是确实发现了一些相邻基因共表达的例子。例如，在T.reesei基因组第29条scaffold的CAZyme基因簇区，外切纤维二糖水解酶cel7a、纤维素膨胀因子和木聚糖酶4在槐二糖和纤维素诱导下同时表达。上述结果表明，CAZyme基因成簇分布具有重要的意义。由于这些区域与其他真菌没有共线性的信号，表明在T.reesei中这些基因发生了重排，这种重排对其在进化上是有利的。在几个CAZyme基因密度高的区域也包含与次级代谢有关的蛋白编码基因。在25个CAZyme基因簇中，有5个基因簇都包含一个聚酮合酶（PKS）或非核糖体肽合成酶（NRPS）基因。另外，与其他Sordariomycetes真菌相比，T.reesei中保留了大多数非核糖体肽合成酶（NRPS）的旁系同源基因。
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木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌。绿色木霉是木霉菌中具有重要经济意义的一种， 目前在工业、农业和环境科学等方面有着广泛的用途。绿色木霉在自然界分布广泛，常腐生于木材、种子及植物残体上。绿色木霉能产生多种具有生物活性的酶系，如：纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶等。绿色木霉是所产纤维素酶活性最高的菌株之一，所产生的纤维素酶的降解作用， 目前日益受到重视，国内外对这方面的研究也很多。同时，绿色木霉又是一种资源丰富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用。它的作用机制有以下几种：产生抗生素；重寄生作用，这是木霉菌作为拮抗菌最重要的机制；溶菌作用；竞争作用。
木霉中糖类及其功能
糖类是四大类生物大分子之一，是主要的初级代谢产物。糖类包括单糖、寡糖、多糖和糖复合体，几乎存在于所有生物体中。在木霉中，糖类可以作为生物体的结构成分，例如绿色木霉（T.viride）孢子的细胞壁中包含β-1，3-葡聚糖，β-1，6-葡聚糖等糖类物质（Benitez et al.，1976）；可以作为生物体内的主要能源物质，例如 Danielson等（1973）曾研究发现最适合木霉利用的碳源为葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖、海藻糖和纤维二糖（Danielson et al.，1973）；可以在生物体内转变成其他物质，例如葡萄糖可以通过戊糖磷酸途径生成核苷酸所需的戊糖；可以作为细胞识别的信息分子，例如某些具有真菌寄生能力的木霉，其细胞壁及培养滤液中含有半乳糖和N-乙酰基-β-D-半乳糖胺类凝集素，可能与重寄生过程中的识别有关（Neethling et al.，1996）。5.1.1.1 寡糖木霉内寡糖多数是由多糖水解产生的，例如木霉内几丁寡糖是将几丁质经特殊的生物酶技术处理而得到的（沈奕等，2009a，2009b；谢宇等，2008）。它具有抗菌、提高植物防御能力等多种生理功能，沈奕等（2009a，2009b）研究发现，利用几丁寡糖溶液浸种处理能显著提高烟草种子发芽率和发芽势，而且提高烟草种子体内过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性；而且几丁寡糖处理也可显著提高烟草对黑胫病和赤星病的防治效果，提高了烟草体内的SOD，POD，PPO和几丁质酶的活性（沈奕等，2010；高智谋等，2009）。5.1.1.2 多糖真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、菌核或者发酵液中分离的一类由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的大分子物质。真菌多糖例如葡聚糖、纤维素、几丁质是真菌细胞壁的主要组分。木霉细胞壁结构为几丁质-β-葡聚糖类型（Griffin，1994），对此观点多数研究者已经达成共识（Benitez et al.，1975；Messner et al.，1990 a；Nevalainen et al.，1995）。木霉中孢子细胞壁和菌丝细胞壁的多糖种类存在差异，例如绿色木霉（T.viride）孢子细胞壁的多糖为β-1，3-葡聚糖，β-1，6-葡聚糖，而菌丝中的多糖为几丁质（Benitez et al.，1976）。丝状真菌细胞壁中也含有少量杂多糖，如Gomez-Miranda等（1990）在绿木霉（T.virens）的细胞壁中发现了杂多糖，这种杂多糖与Rath等（1995）从里氏木霉（T.reesei）培养液和细胞壁中分离的杂多糖相似，据报道，这种杂多糖与β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶在细胞壁上的结合有关（Messner et al.，1990b）。目前，已从真菌中分离获得大量的多糖类物质（Liu et al.，2008），而且已有文献报道，真菌细胞壁多糖物质对植物抗病性有诱导作用（李默怡等，2003；岳东霞等，2004），目前大量的研究主要集中在多糖类物质在生化和医学领域的免疫调节和抗氧化生物活性（Ooi et al.，2000；Wang et al.，2008；Liu et al.，2010）。目前也从不同木霉中获得了不同的多糖类物质，并对其生物活性进行了研究分析。例如假康氏木霉（T.pseudokoningii）细胞壁多糖（TPWS）对黄瓜幼苗的抗病性具有诱导作用，可增强黄瓜幼苗对尖镰孢孢子的防御作用，并增强了PAL及POD的活性和木质素的含量（郭敏等，2009）；假康氏木霉（T.pseudokoningii）胞外多糖具有显著提高黄瓜内水杨酸含量，诱导黄瓜幼苗活性氧产生，诱导植物防御反应的作用（魏广金等，2009a，2009b），对番茄灰霉病的抗性和几种防御酶活性也具有诱导作用（郭敏等，2005），还能显著诱导脾淋巴细胞增殖，促进巨噬细胞的吞噬活性，抑制白血病细胞K562的增殖，使体内具有良好的免疫作用，能增强小鼠的体液免疫、细胞免疫，是一种良好的免疫调节剂，并具有抗肿瘤活性（Huang et al.，2012；李丽华等，2013a，2013b）。
木霉中蛋白质代谢
蛋白质是由氨基酸经过缩合形成肽链，肽链经过不同形式折叠形成的。Wilhite等（2001）从绿木霉（T.virens）中克隆了一个5056 bp的编码肽合成酶（PSY1）的cDNA片段。基于EST数据库，从哈茨木霉（T.harzianum）CECT2413中分离获得一个编码的PTR家族二/三肽转运体的基因ThPTR2。分析ThPTR2蛋白质序列发现，其具有PTR转运体的保守基序和12个跨膜域。此外，ThPTR2 转化长枝木霉（T.longibrachiatum）T52，过表达ThPTR2，证明了该基因在肽转运中的作用。ThPTR2首次被实验证实为丝状真菌中PTR家族转运蛋白（Vizcaínoa et al.，2006）。蛋白质水解产生不同的氨基酸，Sanz等（2004）也利用18株木霉对5种公认的同工酶β-1，3-葡聚糖酶（EC3.2.1.39，EC3.2.1.58）、β-1，6-葡聚糖酶（EC3.2.1.75）、纤维素（EC3.2.1.4，EC3.2.1.21，EC3.2.1.91）、几丁质酶（EC3.2.1.30，EC3.2.1.52）和蛋白酶（EC3.4.11，EC3.4.13-19，EC 3.4.21-24，EC3.4.99）的活性进行了多态性分析。唐雯等（2008）利用生物信息学方法对里氏木霉（T.reesei）分泌组进行分析，其中，在188条水解酶序列中，属于蛋白水解酶的序列有33条，包括羧基肽酶（3.4%）、氨基肽酶（1.7%）和天冬氨酰蛋白酶（4.76%）等；在功能未知的水解酶中，发现具有潜在蛋白水解酶功能的序列9条（精氨酸酶、丝氨酸酶和金属钛酶）。上文提到，在木霉中发现了大量的胞外蛋白水解酶，进行了蛋白质水解。Geremia等（1993）在木霉中鉴定了一个基本的蛋白酶（PRB1），蛋白酶经纯化和生化特征分析发现是一种31kDa大小，等电点为9.2的丝氨酸蛋白酶。Dunaevsky等（2000）确定哈茨木霉（T.harzianum）分泌的胞外蛋白酶是一种对Z-丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-pNa-枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的底物具有活性的蛋白酶。Kredics等（2004）对6个长枝木霉（T.longibrachiatum）菌株的胞外蛋白水解酶分析发现，其水解酶具有类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和类凝乳弹性蛋白酶的蛋白酶活性。一个编码细胞外天冬氨酰蛋白酶的基因papA从哈茨木霉（T.harzianum）CECT 2413中被分离鉴定。从过表达哈茨木霉 CECT 2413papA的转化酵母培养物中提取的蛋白酶活性相比野生型增加了四倍（Delgado-Jarana et al.，2002）。随后，新的天冬氨酰蛋白酶在哈茨木霉（T.harzianum）（Suáreza et al.，2005；Liu et al.，2007）、棘孢木霉（T.asperellum）（Yang et al.，2013）中被分离获得。里氏木霉（T.reesei）天冬氨酸蛋白酶（TrAsP）的晶体结构也被研究，TrAsP的三维结构与胃蛋白酶样家族的其他成员结构类似。每个分子都折叠成一个N-末端和C-末段相同大小的β-折叠片的结构（Nascimentoa et al.，2008）。同时，丝氨酸蛋白酶也从哈茨木霉（T.harzianum）（Suarez et al.，2004；Liu et al.，2013）、绿木霉（T.virens）（Pozo et al.，2004）、假康宁木霉（T.pseudokoningii）（Chen et al.，2009）中被分离，编码这些水解酶的基因被克隆。甲丝氨酸肽链内切酶已从绿色木霉（T.viride）培养物滤液中被纯化。确定的等电点为7.3。研究发现，类胰蛋白酶为绿色木霉（T.viride）中含有的特异性蛋白酶（Uchikoba et al.，2005）。Kredics等（2008）从 11 株木霉中筛选深绿木霉（T.atroviride）T221具有耐寒性，在含酪蛋白培养基上培养的深绿木霉（T.atroviride）T221培养液中分离获得一种分子量为24kDa的酶，该酶等电点为7.3，最佳 pH 值为6.2，反应最适温度为25℃并具有低温稳定性，是一个真正的冷适应性酶。底物特异性的数据表明，这种酶是一种优先作用于 Arg 或 Lys的 P1 位置的蛋白酶（Kredics et al.，2008）。Mattinen等（2008）在里氏木霉（T.reesei）中分离一种新的酪氨酸酶（TrTyr），具有催化氧化、氧化交联的牛血清白蛋白（BSA）和β-酪蛋白肽链中的L-酪氨酸和酪氨酸长链的活性。Dixit等（2011a）从绿木霉（T.virens）中克隆获得一个谷胱甘肽转移酶基因TvGST，TvGST转基因植物对重金属镉表现出更强的耐受性（Dixit et al.，2011）。Saloheimo等（1999）在里氏木霉（T.reesei）中分离一个编码蛋白质二硫键异构酶的基因pdi1。里氏木霉（T.reesei）pdi1的 mRNA的水平受碳源调控，在含葡萄糖培养基中表达量最低，在含可以诱导胞外酶基因表达的碳源的培养基上表达量最高（Saloheimo et al.，1999）。
木霉中糖类代谢
与其他生物类似，糖类是木霉中的主要能源物质，木霉的生长需要碳源，最适合的碳源为糖类（详见第4章）。木霉细胞外的碳源通过不同途径转化成葡萄糖，进入细胞内，然后葡萄糖分解代谢提供木霉生长所需的能量。如图5.1 所示，木霉可以通过葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶等对环境中的淀粉、纤维素进行降解，产生葡萄糖，或者培养基中含有的葡萄糖可以通过葡萄糖转运进入细胞内，葡萄糖的转运有一活跃的转运系统进行，其他真菌，例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和链孢霉（Neurospora crassa）的糖转运系统已被充分研究（Boles et al.，1997；Lagunas，1993；Marger et al.，1993；Özcan et al.，1999；Rand et al.，1980a，1980b）。Delgado-Jarana等（2003）从哈茨木霉（T.harzianum）CECT 2413中分离了一个编码葡萄糖转运蛋白的基因gtt1.，该基因编码含12个跨膜结构域和若干典型的糖转运域的葡萄糖转运蛋白。其表达受高葡萄糖抑制，受pH影响，说明木霉内葡萄糖转运受 pH 影响（Delgado-Jarana et al.，2003）。里氏木霉（T.reesei）的ΔTrhxt1突变体表现出葡萄糖积累的表型，鉴于此，Ramos等（2006）在里氏木霉（T.reesei）中分离了一个预测编码葡萄糖转运蛋白的基因Trhxt1，并发现该基因的表达受高葡萄糖浓度的抑制，并受氧浓度的调控（Ramos et al.，2006）。Trhxt1在不存在葡萄糖的情况下，其表达在微摩尔水平，当里氏木霉（T.reesei）在含纤维素的培养基上生长时，纤维素的降解使葡萄糖浓度达到微摩尔水平时也诱导该基因的表达，并且该基因在缺氧情况下表达明显下调（Ramos et al.，2006）。图5.1 葡萄糖的合成和代谢葡萄糖或者其他单糖的胞外氧化，在其他真菌中常有报道，但在木霉和粘帚霉中则还未见。里氏木霉（T.reesei）和深绿木霉（T.atroviride）中没有葡萄糖氧化酶，但是黑曲霉（Aspergilus niger）的葡萄糖氧化酶能够在深绿木霉（T.atroviride）和里氏木霉（T.reesei）中表达并具有活性（Mach et al.，2004；母敬郁等，2006）。有报道发现，在木素木霉（T.lignorum）、绿色木霉（T.viride）和钩状木霉（T.hamatum）中有抗坏血酸氧化酶（Hatsutori et al.，1994；Nakanishi，1995）。微生物可以利用不同的碳源，而且不同微生物对碳源的选择和利用效率存在很大差异。当优先选择的碳源存在时，其他碳源的代谢会被一种复杂而严谨的过程抑制，这就是所谓的碳代谢阻遏。为了研究木霉中碳代谢阻遏，利用兼并引物从里氏木霉（T.reesei）和哈茨木霉（T.harzianum）中克隆获得了葡萄糖阻遏基因 cre1，cre1 编码包含锌指的C2H2型DNA结合蛋白，CRE1蛋白与构巢曲霉（A.nidulans）中葡萄糖阻遏基因creA的编码产物相似度为46%。cre1 启动子中包含一些与先前验证的构巢曲霉（A.nidulans）creA基因中结合位点一致的序列元件，creA/CRE1的结合位点是由紧密相连的两个5′-SYGGRG-3′基序组成，并且直接抑制作用仅发生在这种双结合位点（Cubero et al.，1994；Strauss et al.，1995；Ilmén et al.，1996；Takashima et al.，1996a，1996b）；另外，在一小段保守的碱性区域内的色氨酸磷酸化也调节CRE1的DNA结合能力（Cziferszky et al.，2002）。里氏木霉（T.reesei）QM9414中cre1mRNA水平受碳源的影响，在含有葡萄糖的培养基上，cre1mRNA水平降低。这些结果表示cre1的表达可以自我调控。有趣的是，里氏木霉（T.reesei）含有突变体Rut-C30，cre1基因被切断，突变体内cre1基因片段（cre1-1）仅编码含有一个锌指的95个氨基酸，其碳降解物阻遏因此得到解除，它的葡萄糖透过酶活性非常低下，可以超量生产纤维素分解酶，与QM9414不同，Rut-C30可以在含有葡萄糖的培养基上产生纤维素酶mRNAs，将cre1全长转入Rut-C30菌株可以造成cbh1表达的葡萄糖抑制，说明cre1调控纤维素酶的表达（Ilmén et al.，1996）。碳代谢阻遏抑制表达的基因模型系统已被用于大多数真菌中碳代谢阻遏的研究，而对消除碳代谢阻遏后的基因表达变化很少有人研究。creA/cre1敲除突变体表现出减慢生长、菌丝形态和产孢异常等表型（Shroff et al.，1997；Nakari-Setälä et al.，2009）。Portnoy等（2011）对里氏木霉（T.reesei）的Δcre1突变体和野生型中基因表达差异进行了芯片分析，首次对真菌碳代谢阻遏的分子生理反应进行全面的研究（Portnoy et al.，2011）。如图5.2所示，按照基因表达情况将其分为不同的集群，其中在Δcre1突变体中高表达的基因又因为受生长速率的影响表现为不同的集群：在Δcre1突变体中高表达并不受生长速率影响的C组包含16个基因，仅在具有高生长速率的Δcre1突变体中高表达的基因为E组50个，G组26个基因，Δcre1突变体中的高表达抵消高生长速率抑制表达的影响，26个H组基因在低生长速率的Δcre1突变体中上调表达。而在Δcre1突变体中抑制表达的基因可进一步分为高生长速率诱导表达（F组，36个基因）和低生长速率诱导表达两组（D组，36个基因）。图5.2 表达集群间的基因分布注：根据芯片数据，按CRE1的不同调控分为9个集群（CRE1诱导，CRE1抑制，CRE1非依赖）。颜色表示生长率的影响，黑色和深灰色集群表示基因仅受较高生长速率影响，其中深灰色（B、F、G）为表达上调，黑色（A、E）为表达下调，浅灰色（D、H）表示低生长速率上调表达的基因，阴影（C）表示表达不受生长速率影响的基因（Portnoy et al.，2011）其中图5.2各集群中的基因包含细胞组分合成、细胞防御、细胞信号、细胞转运、蛋白活性调控、具有结合功能蛋白、蛋白命运、转录、能量、次生代谢、脂类代谢、碳代谢、氨基酸代谢、一般代谢、特异蛋白、假定蛋白等相关基因。胞内的葡萄糖通过糖酵解（Glycolysis）和戊糖磷酸途径（Pentose Phosphate Pathway）进行分解代谢（图5.1，图5.3），以下主要从糖酵解和戊糖磷酸途径两方面对糖类分解代谢进行总结。5.1.2.1 糖酵解作用：将葡萄糖转变成丙酮酸糖酵解作用是葡萄糖转变成丙酮酸的一系列反应，该途径中的关键酶为己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶（图5.3）。有人研究了里氏木霉（T.reesei）中己糖激酶和葡糖激酶及它们在糖类分解代谢中的可能作用（Kubicek-Pranz et al.，1991），发现在不同碳源基质上培养时，能够检测到分别对葡萄糖和果糖具有活性的酶，表明该菌至少能够产生一种己糖激酶和一种葡萄糖激酶。然而，Samuels等（1994）利用电泳技术检测了几种木霉和肉座菌的同工酶，只发现了一个己糖激酶。这种分歧还需要进一步澄清，但两种酶在碳降解物阻遏被解除的里氏木霉（T.reesei）突变株Rut-C30 及F4 或F5 中活性没有改变（Labudova et al.，1983），在两个2-脱氧葡萄糖抗性突变株中也没有改变，表明己糖激酶或者葡萄糖激酶在木霉的葡萄糖调控中没有作用，后来利用构巢曲霉（A.nidulans）进行的研究也得出了类似结论（Ruyter et al.，1996）。图5.3 碳代谢的主要途径：糖酵解途径和磷酸戊糖途径对其他糖酵解酶类在基因水平上进行了研究，由于这些酶类理论上的表达很强，对表达工具的构建具有潜在的应用价值。甘油醛-3-磷酸脱氢酶已经从康宁木霉（T.koningii）中分离纯化，其编码基因也已克隆得到（Sakai et al.，1990）。该酶有两种同工酶，它们的区别在于对康宁酸（Koningic Acid）的敏感性不同，康宁酸是由康宁木霉（T.koningii）产生的一种抗生性代谢产物。研究认为氨基酸残基的差别是造成两种酶对康宁酸敏感性不同的原因，其中一种酶的氨基酸残基在174和181为丙氨酸和丝氨酸，而另一种酶在174和181位分别为苏氨酸和苏氨酸（Watanabe et al.，1993）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因也已经从哈茨木霉（T.harzianum）中克隆得到，而且在光诱导的产孢过程中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（gpd）mRNA 水平下调，在分生孢子梗和分生孢子中含量最低（Puyesky et al.，1997）。Vanhanen等（1989）和Goldman等（1992）分别从里氏木霉（T.reesei）和绿色木霉（T.viride）中克隆到了编码3-磷酸甘油酸激酶的基因，其5′-端序列含有保守的结合位点，该位点可结合环腺苷控制因子、一种催化蛋白质和碳分解物阻遏抑制因子cre1（Vanhanen et al.，1989；Goldman et al.，1992b）。里氏木霉（T.reesei）的3-磷酸甘油酸激酶基因pgk1还包含一个热激共有序列，对热胁迫没有反应（Vanhanen et al.，1991）。丙酮酸激酶的编码基因也已经从里氏木霉（T.reesei）中克隆到，其蛋白质结构与黑曲霉（A.niger）和构巢曲霉（A.nidulans）的丙酮酸激酶高度相似（Schindler et al.，1993）。在里氏木霉（T.reesei）中，同工酶电泳结果发现了2～3个丙酮酸激酶条带，但点杂交却只发现了一个基因（Schindler et al.，1993）。有证据表明，丙酮酸激酶存在磷酸化现象，这可能就是发现两个电泳迁移条带的原因。木霉也能够在非糖类碳源中生长，Jackson（1973）研究了绿色木霉（T.viride）对丙烯基乙醇的降解代谢途径，发现进一步的产物为丙烯酸和乙酸，后者进一步代谢为丙酮酸酯，可累积到原始底物量的50%（w/w）（Jackson，1973）。Tye等（1977）通过在甲醇培养基上连续培养，研究了木素木霉（T.lignorum）生长情况，发现最适生长速率较低（μ＝0.026），而且只在低浓度甲醇条件下（0.16%）才能生长。5.1.2.2 磷酸戊糖途径另一种常见的糖类分解代谢是磷酸戊糖途径（图5.3）。葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate）被转化成果糖-6-磷酸（Fructose-6-phosphate）和甘油醛-3-磷酸（Glyceraldehydes-3-phosphate），反馈进糖酵解途径内。糖酵解途径的主要产物为丙酮酸，戊糖磷酸循环则可以为核酸和核苷酸合成提供戊糖，还可以为辅酶、能量载体等提供NADPH，也可以提供赤藓糖磷酸（Erythrose Phosphate）借莽草酸途径（Shikimic Acid Pathway）合成芬芳族氨基酸（Aromatic Amino Acids）。该路径的关键酶是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）。已知真菌对葡萄糖-6-磷酸的分解代谢涉及糖酵解和戊糖磷酸途径，两者所起作用的比例依细胞需要而异。对于戊糖磷酸途径来说，在长枝组的木霉种类中发现了至少2种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的同工酶（Samuels et al.，1994），但Stasz等（1988a）在绿色木霉（T.viride）、哈茨木霉（T.harzianum）、绿木霉（T.virens）、康宁木霉（T.koningii）、钩状木霉（T.hamatum）和多孢木霉（T.polysporum）的菌株中仅检测到单一酶。Stasz等（1988a）检测的是不同菌株的同工酶，因此在方法上是能够发现同工酶差异的，因此他们与Samuels等（1994）结果的差别，很可能是由所使用的菌株不同造成的。Neto（1993）分离纯化并研究了糖酵解途径的磷酸果糖激酶2，该酶在调控方面具有重要意义，发现它不为环腺苷依赖型的磷酸化所调解控制，只为底物的可利用性所调控，这种现象与酵母不同，但与早期关于黑曲霉（A.niger）的报道一致（Harmsen et al.，1992）。磷酸戊糖途径是NADPH的主要来源，NADPH是许多生物分子尤其是脂类合成所必需的（Berg et al.，2002）。它也为合成氨基酸提供中间产物：组氨酸由核糖-5-磷酸合成，赤藓糖-4-磷酸是合成芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）的前提（Berg et al.，2002）。因此，磷酸戊糖途径在蛋白质的合成中起重要作用，被认为与蛋白质高效生产的生物系统相关。磷酸戊糖途径中间产物核糖-5-磷酸也是核酸和核苷酸合成所必需的。磷酸葡萄糖异构酶（PGI）催化糖酵解途径的第二步，使葡萄糖-6-磷酸转变成果糖-6-磷酸。这一酶位于糖酵解和磷酸戊糖途径的第一个结合点，PGI的失活导致代谢流转向磷酸戊糖途径，使产生更多的NADPH。在大肠杆菌（Escherichia coli）中发现PGI的突变株pgi能够产生更多的核苷酸和氨基酸前体（Canonaco et al.，2001）。里氏木霉（T.reesei）中pgi基因被克隆，并且通过里氏木霉数据库分析发现没有与其同源的ORFs（Limón et al.，2011）。5.1.2.3 葡萄糖代谢命运糖酵解途径最终将葡萄糖降解成丙酮酸，丙酮酸可以通过有氧呼吸最终产生 CO2，H2O和ATP，也可以通过厌氧途径生成乳酸（图5.1）。研究表明，关键基因的调控变化，控制里氏木霉（T.reesei）中糖酵解途径产物丙酮酸进入有氧或是厌氧途径（Chambergo et al.，2002）。Chambergo等（2002）建立了丝状真菌里氏木霉（T.reesei）的EST数据库。Derisi等（1997）利用的互补DNA芯片技术分析了葡萄糖耗尽时的基因表达谱，并与酿酒酵母（S.cerevisiae）发酵过程中基因时空表达模式进行了比较（图5.4）。里氏木霉（T.reesei）被选为这项研究的材料，因为它的自然栖息地和对营养的要求与酿酒酵母（S.cerevisiae）明显不同。酿酒酵母（S.cerevisiae）一般需要一个高糖浓度的生长环境，而里氏木霉（T.reesei）可以在营养缺乏的环境中生长，并利用胞内水解酶，例如纤维素酶对周围环境中多糖进行水解获得葡萄糖（Beguin，1990）（图 5.1）。对里氏木霉（T.reesei）在葡萄糖耗尽时基因表达模式的分析发现，糖酵解途径最终产物丙酮酸进入有氧而非厌氧途径。而且，在里氏木霉（T.reesei）表达谱中发现了编码三羧酸循环中酶和电子传递链中蛋白质的基因的表达，表明丙酮酸的氧化是通过三羧酸循环进行的，而不是通过发酵产生乙醇，而且乙醛被氧化生成醋酸，而不是还原产生乙醇，从而防止NADH的再生（Chambergo et al.，2002）。氧气是决定丙酮酸进入有氧途径还是厌氧途径的关键因子，同时，氧气还影响丙酮酸生成的糖酵解途径中关键酶基因的表达。Bonaccorsi等（2006）证明，短暂的缺氧可以抑制糖酵解途径中关键酶基因的表达，并比较了不存在氧时里氏木霉（T.reesei）和酿酒酵母（S.cerevisiae）中糖酵解途径中基因的表达变化（Bonaccorsi et al.，2006）。5.1.2.4 葡糖异生途径真菌虽然通过糖酵解途径，可以利用多样的碳源，但如果真菌生长在醋酸培养基上，真菌就要通过糖异生途径合成各种碳水化合物（图5.1）。所谓糖异生，是指非糖的前体物质（例如，乳酸、氨基酸、甘油等）合成葡萄糖的过程。糖异生途径不是糖酵解途径的简单逆转，因为糖酵解作用的激酶（己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶）是不可逆的。糖异生途径为：丙酮酸羧化转变成草酰乙酸，然后磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶将之脱羧和磷酸化生成磷酸烯醇丙酮酸，在经糖酵解途径中的可逆反应转变成果糖-1，6-焦磷酸，提供给寡糖和多糖的合成（图5.1）。图5.4 当葡萄糖消耗完时，里氏木霉（T.reesei）和酿酒酵母（S.cerevisiae）中编码参与在关键代谢过程中酶的基因表达谱的比较注：↑和↓的框架分别表示葡萄糖耗尽时表达量升高和降低的基因，→表示表达不受影响的基因，*表示尚未从木霉中分离获得的基因，ADH基因在木霉中没有获得，但是在木霉培养物种乙醇脱氢酶的活性被检测到（Beutler，1984）。其中，FBA：果糖-1，6-二磷酸醛缩酶；TPI：磷酸甘油醛异构酶；TDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶；PGK：磷酸甘油酸激酶；GPM：磷酸甘油酸变位酶；ENO：烯醇化酶；PYK：丙酮酸激酶；PDA：丙酮酸脱氢酶；PCK：磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶；PDC：丙酮酸脱酸酶；ALD：乙醛脱氢酶；ADH：乙醇脱氢酶；ACS：乙酰辅酶A合成酶；CIT：柠檬酸合成酶；ACO：顺乌头酸酶；IDH：异柠檬酸脱氢酶；KDH：a-酮戊二酸脱氢酶；YGR：琥珀酸硫激酶；SDH：琥珀酸脱氢酶；FUM：延胡索酸酶；MDH：苹果酸脱氢酶（Chambergo et al.，2002）
木霉中氨基酸代谢
众所周知，大多数木霉能够利用多种复杂化合物作为氮源来生长，因此，木霉应该具有同化相应化合物的酶类。在铵离子作为氮源时，许多木霉例如哈茨木霉（T.harzianum）、深绿木霉（T.atroviride）、橘绿木霉（T.citrinoviride）、绿色木霉（T.viride）、绿木霉（T.virens）和康宁木霉（T.koningii）的两种同化氨的关键酶保持很高水平，分别是谷氨酰胺合成酶和NADPH-谷氨酸脱氢酶（Ahmad et al.，1995）。哈茨木霉（T.harzianum）和深绿木霉（T.atroviride）含有单一的阴离子型谷氨酰胺合成酶、NADPH-谷氨酸脱氢酶、丙氨酸转氨酶，以及天门冬氨酸转氨酶的两种同工酶（Ahmad et al.，1995）。酪氨酸诱导型的酪氨酸转氨酶在绿色木霉（T.viride）中也有发现（Echetebu，1982），该酶将氨基转移到a-酮戊二酸上。一种推断性氨基酸透过酶的编码基因曾经从哈茨木霉（T.harzianum）克隆得到（Vasseur et al.，1995）。跟大多数真菌一样，木霉含有一些L-氨基酸氧化酶（Smirnova et al.，1989），最近从哈茨木霉（T.harzianum）的细胞外蛋白质中分离获得一种L-氨基酸氧化酶（Th-LAAO），可以与细菌或真菌细胞壁蛋白相互作用导致菌体死亡。Th-LAAO 导致细菌膜通透性和H2O2的产生，是TH-LAAO的抗菌活性的机制（Yang et al.，2011a，2011b；2012）。目前，木霉中一些特定的L-氨基酸氧化酶也被分离并进行了生理生化特性的鉴定，例如L-亮氨酸-a-氧化酶（Smirnova et al.，1987a，1987b），L-蛋氨酸氧化酶（Smirnova et al.，1988），L-苯丙氨酸-a-氧化酶（Smirnova et al.，1988），以及L-赖氨酸-a-氧化酶（Kusak-abe et al.，1980；Hu et al.，1994；Weber et al.，1994；Smirnova et al.，2009；Arinbasa-rova et al.，2012 a，2012b；Pokrovsky et al.，2013）。对L-赖氨酸-a-氧化酶的研究比较详细，因为它在体外具有显著的抗增殖活性，在体内抗肿瘤治疗中起有效作用（Kusakabe et al.，1980，1988；Pokrovsky et al.，2013）。Selinheimo等（2006）利用同源性序列搜索，在丝状真菌里氏木霉（T.reesei）中发现一个新的木霉酪氨酸酶基因tyr2，这是第一次报道的分泌型真菌酪氨酸酶。里氏木霉（T.reesei）TYR2 对L-酪氨酸和L-多巴都有活性，表现出广泛的底物特异性。里氏木霉TRY2 被报道能够氧化多种肽与蛋白结合氨基酸，Westerholm-Parvinen等（2007）将TYR2在毕赤酵母中进行表达，并利用同位素标记对其理化性质进行了研究。El-Sayed（2009）描述了一种利用固态发酵在康宁木霉（T.koningii）中生产L-谷氨酰胺酶的方法。谷氨酸脱羧酶（GAD；EC4.1.1.15）是生物催化 L-谷氨酸的 a-羧基脱羧反应生成GABA的唯一酶，广泛分布于从单细胞生物到哺乳动物的各种有机体活细胞中。在真菌中分生孢子、基内菌丝和气生菌丝中均有GAD，主要存在于分生孢子中（ et al.，2001）。谷氨酸脱羧酶GAD已经被分离纯化，并且被证明在分生孢子培养基中表达（Hao etal.，1991，1993）。Kumar等（2000）在黑曲霉（A.niger）菌丝体中发现GABA旁路。在绿色木霉（T.viride）中 GAD 活性受发育的调控并且在非分生孢子突变体中不存在（ et al.，2001）。 等（2001）对绿色木霉（T.viride）分生孢子匀浆、液体培养物和气生菌丝中的GAD进行了测量。发现GAD受2mmEDTA刺激，对钙调素拮抗剂卡米达佐（10mm）或吩噻嗪抗精神病药（60mm）不敏感。环孢菌素A（300mm）可以在匀浆中而不是在匀浆离心后的上清中部分抑制GAD的活性。利用高离子强度、表面活性剂或尿素处理均不能提高GAD活性。而冻融却导致分生孢子匀浆中GAD酶活性增加。这些结果表明GAD是一类膜结合酶。在线粒体或空泡细胞器中GAD活性最高。液体培养中分生孢子的萌发导致GAD活性的暂时降低。延长培养后，GAD活性表现准震荡变化。因此，在绿色木霉（T.viride）中GAD的活性是与发育状况紧密联系的，并代表了分化和能量代谢之间的联系。有关木霉合成氨基酸的研究有限。有一例研究是关于咪唑甘油磷酸脱氢酶编码基因的工作，该酶参与组氨酸的生物合成，通过酿酒酵母（S.cerevisiae）遗传互补，从哈茨木霉（T.harzianum）克隆到了其编码基因，并用作遗传转化标记（Goldman et al.，1992a）。特别引人注意的是，某些菌株能够过量产生某些氨基酸，木霉能够将DL硫代脯氨酸的72%（w/w）转化为L-半胱氨酸（Meiji Seika Kaisha Ltd.，1982）。Pitt等（1981）对黄绿木霉（T.aureoviride）在连续培养时的总氨基酸进行了系统研究，发现谷氨酸和丙氨酸是胞内含量最为丰富的氨基酸种类（60～100及43～135μmoles/g干重，介于0.06～0.20/h）。但同时发现甘氨酸、精氨酸和鸟氨酸也是主要的氨基酸种类（5～9μmoles/g干重）。大多数其他氨基酸的含量一般为1～3μmoles/g干重，生长速度快时，这些氨基酸的含量也较高（Pitt et al.，1981）。
木霉的蛋白质分泌途径
蛋白质的多肽链在细胞质中合成并在内质网膜易位进入分泌途径。在真核生物中有两种类型的蛋白易位过程，即共翻译转运和翻译后转运，前者在哺乳动物细胞中比较常见，而这两种类型共存于酿酒酵母中；丝状真菌中新生多肽的易位主要采用共翻译转运方式。多肽进入内质网后，在一系列折叠酶和伴侣蛋白协助下进行蛋白的正确折叠并装配成寡聚体，同时新合成的多肽被糖基化，核心N-聚糖结合于内质网膜上寡糖转移酶复合体的一个Asn残基上。蛋白质在内质网与高尔基体之间的运输是由转运包被小泡介导的。有COPⅠ和COPⅡ两种类型包被小泡。COPⅡ包被小泡将初步成熟的蛋白质从内质网运输到高尔基体，在COPⅠ包被小泡的帮助下蛋白质穿过高尔基体被运送到反面，同时错误折叠的蛋白也会通过COPⅡ小泡被重新运回内质网进行重新折叠。T.reesei的基因sarT，是编码参与蛋白质从内质网到高尔基体运输过程的蛋白质之一，编码的蛋白质较小，是一种GTP-结合蛋白。来自木霉的该基因编码序列，与酵母sar1基因有72%的同源性，而与曲霉SAR1蛋白有86%的相似性，说明木霉中存在分泌型小泡（Punt et al.，1996；Saloheimo et al.，1996；Kurzatkowski et al.，1996）。初步成熟的蛋白质转运到高尔基体后，继续进行翻译后修饰，例如N-连接的糖基化修饰，O-连接的糖基化修饰和磷酸化等过程。通过超微结构研究，发现在木霉中存在高尔基体（Ghosh et al.，1990；Kurzatkowski et al.，1996），通过生物化学手段，在其他生物中展示了典型的高尔基体相关酶活性，例如Kex2 蛋白酶（Goller et al.，1997），O-甘露糖基化最后一步反应的发生（Kruszewska et al.，1989），真菌分泌型蛋白中前体氨基酸序列中的Kex2型蛋白质裂解目标物，这些都确认在木霉中存在高尔基体。在T.reesei中，分泌型蛋白的Kex2-型裂解很重要，如果抑制Kex2 p活性，将导致分泌蛋白的减少，并且非裂解的蛋白在胞内同时发生积累现象（Goller et al.，1997）。最后，通过高尔基体腔体以后，分泌小泡将蛋白质运送到不同的目标位置，例如液泡、细胞质膜、内吞体等细胞器，在木霉菌丝生长的顶端，小泡与细胞质膜融合，将分泌蛋白释放到周质空间（Valkonen et al.，2003）。过量表达的外源蛋白超出细胞的承受能力，多肽链不能及时正确折叠，从而在内质网内形成错误折叠或未折叠的蛋白质积累，会严重影响蛋白的转运和分泌，这是造成外源蛋白产量低的一个重要因素。在表达系统中，转移到内质网的大流量蛋白对蛋白折叠、转运及合成蛋白的质量控制提出了更高要求。蛋白通过细胞内膜系统的蛋白分泌途径被分泌到细胞表面，分泌蛋白随同细胞内其他位置比如质膜、液泡或高尔基复合体的蛋白一起通过内膜系统转运（Conesa et al.，2001；Spang，2008；Shoji et al.，2008；Sallese et al.，2009；Hutagalung et al.，2011）。蛋白质由N-端的信号序列引导进入分泌途径。在共翻译转运中，信号识别颗粒（SRP）识别新生的转运信号序列，翻译终止。SRP指导核糖体-mRNA-多肽三元复合体易位到内质网膜上。这个复合体由多个蛋白质（包括SEC61）形成一个通道，穿过内质网膜。蛋白边转录边易位，分泌蛋白向内质网腔转移的同时，进行翻译后修饰。在胞质中通过SEC62-SEC72-SEC73亚复合体介导进行翻译后修饰活动，同时多肽通过SEC61通道进入内质网腔。在蛋白质分泌途径中，内质网的重要作用是进行蛋白折叠，使蛋白形成正确的构象，在这个过程中有伴侣分子和折叠酶参与，分子伴侣是一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组分。分子伴侣主要分为伴侣素家族（Chaperonin，Cpn），应激蛋白70家族（Stress-70 Family），应激蛋白90家族（Stress-90 Family）。内质网伴侣分子主要是HSP70家族的成员，该家族成员主要以ATP依赖的方式结合未折叠多肽链的疏水区以稳定蛋白质的未折叠状态，再通过有控制的释放帮助其折叠，参与受损蛋白降解（Parsell et al.，1993），具有耐热性（Sung et al.，2001；Montero-Barrientos et al.，2007，2008）。其中最重要的是BiP（绑定蛋白）。内质网氧化还原传输系统催化形成分泌蛋白的二硫键。另外，分子伴侣hsp70 基因也属于应激蛋白70 家族，是一类分子量约70 KD的高度保守的ATP酶，其功能是提高蛋白对热激和非生物胁迫的耐性（Miersch et al.，2008；Montero-Barrientos et al.，2008），它被称为“细胞温度计”，作为热效应响应的负调节器（Kregel，2002）。Montero-Barrientos 分离到哈茨木霉（T.harzianum）T34 hsp70基因，并通过同源过表达分析其功能，发现其具有耐热性，并能交叉耐受渗透、盐和氧化压力（Montero-Barrientos et al.，2008）。折叠酶属于蛋白二硫化物异构酶家族（PDI）或ERV1家族，通过巯基氧化酶使蛋白正确折叠。脯氨酸顺反异构酶（PPI）是参与蛋白折叠的另外一个折叠酶家族重要成员。新生的分泌蛋白在转运和折叠过程中被糖基化。通过内质网膜上的寡糖转移酶使核心N-聚糖与天冬酰胺残基相连。内质网有一套完善的质量控制系统，监督蛋白的折叠状态，只允许完全正确折叠的蛋白被转运出内质网。错误折叠蛋白或聚集一起的蛋白均被转移出内质网，并被内质网上的蛋白降解系统降解（ERAD，Bernasconi et al.，2011）。分泌蛋白经过折叠与糖基化后才能被分泌到细胞外。这个过程有两个转运小泡参与，首先蛋白从内质网转运到高尔基体，再从高尔基体转运到质膜。在这两个过程中，分泌蛋白通过特异蛋白包被被包裹进膜小泡涂层中，这些小泡再随着细胞相关活动被转运到它们的目的地，最终，小泡与靶标膜融合，将分泌蛋白释放到高尔基体或质膜外（Spang，2008）。这些小泡的形成、转运、融合过程是由一种蛋白复合体控制的，这种复合体的数量很多。有一部分蛋白参与全部膜的融合分泌活动——通用融合因子，例如 SEC17和SEC18/NSF蛋白，其余蛋白只是参与某一个步骤，比如SAR1/ARF1型小G蛋白参与小泡分化，Rab 类型小 G 蛋白参与小泡融合（Hutagalung et al.，2011），v-SNARE-和t-SNARE-蛋白分别位于小泡和靶标膜上。SNARE蛋白在小泡到达靶标膜时能互相识别并绑定在一起，能使小泡和靶标膜特异地融合（Malsam et al.，2008；Kienle et al.，2009）。一些大型蛋白复合体（外囊）在小泡与靶标膜融合体在质膜的定位过程中，起到了重要作用，这些蛋白复合体包括 SEC3，SEC5，SEC6，SEC8，SEC10和SEC15（He et al.，2009）。里氏木霉（T.reesei）是一种嗜温腐生性丝状真菌，具有很好的合成和分泌蛋白的能力，同时具有真核特点的蛋白分泌机制与系统，该机制、系统与哺乳动物的相似，例如高甘露糖型和N-糖基化。对黑曲霉（Aspergillus niger）和里氏木霉（T.reesei）进行的超微结构观察表明，真菌的蛋白分泌途径遵循酵母和高等植物的基本原则（Hemming，1995）（图11.1）。通过转运机制，欲分泌的蛋白质被引向内质网。蛋白分泌过程有信号肽的参与，所有分泌型真菌蛋白质在其N-端附近包含裂解肽；关于木霉分泌性蛋白信号肽情况见表11.1。内质网膜上嵌有负责长醇依赖型蛋白质糖基化的酶，而在内质网腔中则含有负责蛋白质折叠的酶，例如二硫键异构酶（PDI），肽基脯氨酰异构酶（PPI），或者分子伴侣例如BIP或者它们的酵母类似物（Kar2蛋白）。分泌蛋白向内质网腔转移的同时，信号序列丢失，然后进行翻译后修饰，例如O-和N-连接的糖基化，形成二硫键，结构重排以便折叠正确等；有些基因编码折叠酶，或者具有其他酶功能的蛋白，例如O-甘露糖基化，这些现象都在木霉中存在。图11.1 丝状真菌蛋白分泌示意T.reesei中蛋白分泌涉及的基因有：hac1，编码UPR转录因子；ire1，编码UPR响应因子；ptc2，编码UPR负调控因子的磷酸盐（phosphatase acting as a negative regulator of UPR）；sec61，编码内质网膜上蛋白转运体系中的主要组件；pdi1，蛋白质二硫化物异构酶；bip1，lhs1，编码内质网中蛋白折叠相关蛋白-伴侣分子HSP70蛋白家族；sar1，编码从内质网向外分泌小泡过程涉及的小G蛋白；ypt1，编码小泡转运进高尔基体涉及的ras型小G蛋白；nsf1，编码小泡融合过程中涉及的通用融合因子；snc1，编码小泡融合到质膜过程中涉及的v-SNARE蛋白；sso1/2，编码小泡融合到质膜过程中涉及的t-SNARE；ftt1/2，编码蛋白分泌途径中最后步骤涉及的14-3-3型蛋白；rho3，编码细胞极性和小泡与质膜融合涉及的ras型小G蛋白（Saloheimo et al.，2012）
木霉分泌途径的生物化学信息学研究
关于木霉分泌途径的进一步了解，来自于氨基酸序列，这些序列从编码分泌蛋白的基因序列推导出来。这些序列合成后作为前体物质，其中包括一个NH2-端信号肽，位于成熟蛋白分子的前面。信号肽结构与内质网信号肽酶的共有序列具有同源性（Gierasch，1989）。大多数含有Kex2-型蛋白酶的裂解位点（表11.1）。表11.1 木霉分泌型蛋白举例及从核苷酸序列推断的引导肽氨基酸信号序列注：推断信号序列用黑斜体字母标示（Watson，1984）。下划线部分标示KEX-型蛋白酶的作用位点。成熟蛋白的第一个氨基酸用黑体字母表示。*表示序列含有典型的KEX2二盐基氨基酸目标基序（Julius et al.，1984）。从上面数第1～6个蛋白参考Kubicek et al.（1993）；第7个蛋白参考Saarelainen et al.（1993）；第8个蛋白参考Draborg et al.（1996）；第9个蛋白参考Limon et al.（1995）；第10个蛋白参考Garzia et al.（1994）；第11个蛋白参考de la Cruz et al.（1995）；第12个蛋白参考Geremia et al.（1993）。在T.reesei中发现了一个Kex2-型活性蛋白的存在（Goller et al.，1997）：该酶对二元酸/碱残基有特异性，可特异性地为pAPMSF（p-aminophenylmethylsulfonylfluoride）所抑制，在亚细胞组分中，其分布密度较小。向正在分泌纤维素酶的T.reesei 培养物中加入pAPMSF，可使纤维素酶蛋白分泌立即停止，同时，分子量较大的胞内前体物质大量累积。这种现象表明，对木霉的蛋白分泌来说，Kex2对前体蛋白质的加工十分重要。这些特性与酵母中位于高尔基体上的Kex2-型蛋白酶相似（Redding et al.，1991），由此木霉中前体蛋白的加工过程也发生在高尔基体中。另外，还有研究者发现重组牛凝乳酶能够以活性形式分泌（Harkki et al.，1990），由于激活过程涉及低pH条件下凝乳酶蛋白的裂解修饰，认为分泌途径的其中一段反应发生在具有适当的pH及蛋白酶的细胞器中；免疫学研究已经证明，分泌蛋白存在于液泡中，可以推测木霉液泡参与了蛋白质的分泌。该推测也有一些证据支持，例如在CBHI中检测到了甘露糖-6-磷酸（Maras et al.，1997）。唐雯等（2008）应用生物信息学的相关工具对T.reesei已公布的9997条蛋白序列进行信号肽和跨膜区的分析，预测出294条分泌蛋白，通过蛋白功能的预测进行分类，发现T.reesei分泌蛋白中有188种水解酶（64%），包括糖苷水解酶114种（38.78%）、蛋白水解酶42种（14.29%）和脂类水解酶11种（3.74%），其中糖苷水解酶占很大比例，包括很多与纤维素（22种）、几丁质（15种）等多糖降解相关的酶，除了已经确定的23条与木质纤维素降解相关蛋白序列之外，还有30条蛋白序列具有潜在的纤维素酶功能；T.reesei分泌型信号肽中疏水氨基酸残基含量最多，大部分是被Ⅰ型信号肽酶识别并切割，且RR-motif很少，双精氨酸分泌系统（TAT）途径可能不存在或作用很小，C区中的信号肽酶识别位点的氨基酸组成相对保守。Adav等（2012）将里氏木霉菌株QM6a和其高产纤维素酶的突变株Rut C-30在天然木质纤维素基质上培养后，研究了胞外蛋白的分泌情况，共定量测定了230个胞外蛋白条带，其中有纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶、蛋白酶、蛋白移位转送因子及假定功能蛋白，发现两个菌株这类蛋白的分泌，都取决于碳源的性质和碳源的复杂程度。
