质粒的提取方法
从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等。在氢氧化钠（pH12.0-12.6碱性环境）和去污剂SDS的作用下，细菌蛋白质变性，细胞破裂，细菌染色体DNA变性，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变形。但由于质粒DNA相对分子质量较小，公价闭环的DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态，呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会完全分离。将pH调至中性并有高盐存在的条件下，变性质粒DNA又恢复到原来的构型，而大部分染色体DNA和蛋白质难以复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。通过离心沉淀，细胞破碎、染色体DNA及大部分蛋白质等可被出去，而质粒DNA及相对分子质量较小的RNA仍为可溶状态。混杂的RNA可用RNA酶消除，再用酚／氯仿处理，可除去残留蛋白质。在盐和乙醇存在的条件下，进一步离心沉淀质粒DNA。扩展资料分类：根据质粒能否通过细菌的接合作用，可分为接合性质粒和非接合性质粒。接合性质粒带有与接合传递有关的基因。非接合质粒在一定条件下通过与其共存的接合质粒的诱动或转导而传递。根据质粒在细菌内的复制类型可分为两类：严紧控制型和松弛控制型。严紧控制复制型质粒的复制酶系与染色体DNA复制共用，只能在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体停止复制时，质粒也就不再复制。松弛控制复制型的质粒的复制酶系不受染色体DNA复制酶系的影响，在整个细胞生长周期中随时都可以复制，在染色体复制已经停止时质粒仍能继续复制。根据质粒的不相容性，可分为不相容性和相容性。不相容性指结构相似、密切相关的质粒不能稳定地共存于同一宿主细菌内的现象，反之为相容性。常用于流行病学的调查。参考资料来源：百度百科-质粒抽提
质粒提取的基本原理
质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。实验原理提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。详细内容请参考《分子克隆实验指南》。[1] 另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。碱裂解法人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。煮沸法煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是。闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取少至lmL（小量制备），多至250mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株，则不推荐使用该法。这是因为碳水化合物很难除去，会抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大，在CsCl-溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊不清。大肠杆菌菌株HBl01及其衍生菌株（其中包括TGl）能产生大量的碳水化合物，不适于用煮沸法裂解。质粒小提试剂盒用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，它结合了优化的碱裂解法，以及方便快捷的硅膜离心技术，具有高效，快捷的特点，能在30min内完成全部操作。利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA（OD260/OD280=1.7-1.9），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等。
中量质粒提取步骤
操作步骤
( 请自备 50mL 离心管、20mL 离心管、异丙醇、70%乙醇)
1. 取 50mL 菌液，置于 50mL 离心管中，4000rpm 4℃离心 5 min，彻底弃除上清。
2. 加入 20mL 溶液 A，充分振荡 2min，使菌体充分悬浮，确保无絮块存在。4000rpm 4℃离心 5min，彻底弃除上清。
3. 加入 2mL 溶液 I 和 40μL 溶液 B，充分振荡 2min，使菌体充分悬浮，确保无絮块存在。
4. 加入 4mL 溶液 II，盖紧管盖，轻轻颠倒混匀 6 次，注意整个管子的内表面均需与溶液 II 接触，室温放置至溶液清亮。（一般为 4-5min，
如 5min 后溶液未变清亮，说明细菌过多，应考虑减少菌液量。注意混匀手法要温和，不要剧烈混合）
5. 加入 3mL 溶液 III，盖紧管盖，立即轻轻颠倒混匀 8 次，4℃放置 5min。（此步注意要尽快混匀，但手法要温和）
6. 10000rpm 4℃离心 15min，小心吸出上清，轻移至新的 20mL 离心管。（应在离心机自动停转后取出离心管，以免沉淀悬浮）
7. 加入 6mL 异丙醇，充分混匀，室温放置 10min。
8. 10000rpm 室温离心 15min，小心吸弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，吸去残余的液体。（应在离心机自动停转后取出离心管，以免沉淀
悬浮）
9. 加入 3mL 70%乙醇，温和震荡 30Sec，10000rpm 离心 10min，轻轻弃去上清。
10. 重复步骤 9，倒置于干燥的吸水纸上 2min。
11. 将离心管敞口室温放置 5min，晾干沉淀。
12. 加入 100μL 溶液 IV，温和震荡 2min，使沉淀完全溶解。
注意事项：
1、 溶液 II、溶液 III 如出现结晶或者沉淀，可在 37℃水浴中加热几分钟溶解，直至液体恢复澄清。
2、 提取的BIOG质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。 如所提质粒为低拷贝质粒或者大于 10kb 的大质粒，应加大菌体
使用量，同时按比例增加溶液 I、溶液 B、溶液 II、溶液 III 的用量。
碱裂解法提取质粒三种溶液的作用
溶液Ⅰ：葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性；可添加RNaseA消化RNA。 溶液Ⅱ 此步为碱处理。其中NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。这一步要记住两点： 第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断也会慢慢断裂； 第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。 溶液Ⅲ 溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反应。其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS。 因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate,PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。 2M的醋酸是为了中和NaOH。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。 75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上。
碱裂解法提取质粒dna的原理是什么？
其基本原理为：当菌体在NaOH 和SDS 溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后， 质粒 DNA 分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA 不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。相关介绍：细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb 至200kb 以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA 分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA 的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。纯化质粒DNA 的方法通常是利用了质粒DNA 相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA， 经过苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA 已可满足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
